Trends Cell Biol︱徐铭团队从单细胞层面评述衰老细胞的异质性及研究进展

撰文︱Pengyi Yan

责编︱王思珍

制版︱查佳雪

衰老是常见慢性疾病在老年群体中发病率增加的首要风险因子。因此，基于减缓慢性疾病发展的抗衰策略，被认为能够提高老年人的健康水平。由于清除衰老细胞被证实可以延缓机体衰老及众多衰老相关疾病的发展，所以特异性清除衰老细胞的药物（senolytic drugs）相关的动物学研究，临床前以及临床试验目前已逐渐开展[1]。在感知到各种压力信号时，细胞会进入到一种不可逆的细胞周期阻滞状态，称之为细胞衰老（cellular senescence），同时伴随负向细胞周期调控因子p16与p21的高表达。此前，基于p16建立的小鼠模型的相关研究，已经为衰老领域带来诸多重要的发现。但是因为（1）并非所有p16高表达（p16^high）的细胞是衰老细胞[2]，（2）部分类型的衰老细胞也并不表达p16 [3,4], 所以p16并不是一个高特异性和灵敏性的细胞衰老标志分子。事实上，包括p21、p19、uPAR和GPNMB在内的多种细胞衰老标志物相关的研究，已经证实衰老细胞在不同组织中表现出高度的异质性。因此，需要更多的动物模型和技术方法去学习衰老细胞的异质性，发现更特异的细胞衰老标志物，从而理解衰老细胞在不同组织中，不同生理和病理条件下的功能，同时也为senolytics药物开发提供分子基础。

2022年5月20日，康涅狄格大学衰老研究中心徐铭教授课题组受邀在Trends in Cell Biology上发表了题为“The heterogeneity of cellular senescence: insights at the single-cell level”的综述文章。作者们首先总结了当前对于衰老细胞的生物学认知，进而讨论了当前用于研究衰老细胞异质性的生物技术和分析策略，随后评述了在单细胞水平上检测衰老细胞的转录组学特征的最新研究进展，最后指出了未来的研究方向。

一、当前衰老细胞的生物学认知

基于“人类成纤维细胞在体外不能无限增殖从而最终进入到不可逆的细胞周期阻滞的状态”这一实验现象，细胞衰老这一概念于20世纪60年代被提出。随后在2011年的一项开创性研究中表明，通过清除早衰小鼠中p16^high细胞，能够显著提高组织功能[5]，自此衰老细胞在体内的研究大量开展。截至目前，衰老细胞已经被证实在机体老化，衰老相关性疾病以及伤口愈合、胚胎发育等生理过程中累积，而在年轻健康的个体中鲜少观测到。衰老细胞主要表现出以下几个特征（图1）：（1）促炎衰老相关分泌表型（proinflammatory senescence-associated secretory phenotype，SASP）；（2）增大的细胞体积和颗粒物（granularity）；（3）溶酶体中衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性以及脂褐质（lipofusin）的堆积；（4）细胞质DNA堆积；（5）抗凋亡通路激活；（6）一系列细胞核内部的变化如Lamin B1下降、端粒损伤和缩短、衰老相关的异染色质灶（senescence-associated heterochromatin foci，SAHF）等。

图1 当前衰老细胞的生物学特征总结

（图源：Cohn, Rachel L. et al. Trends Cell Biol, 2022）

二、衰老细胞的异质性

源于“各类型衰老细胞对于不同的senolytics表现出不同程度的敏感性”这一实验结果，衰老细胞的异质性首次被观测到。例如，达沙替尼（Dasatinib）有效清除衰老的脂肪前体细胞，栎精（quercetin）则更特异性地清除内皮细胞[6]。非瑟酮（Fisetin）和navitoclax 能够同时清除衰老的成纤维细胞和内皮细胞，但对于衰老的脂肪前体细胞影响甚微[7, 8]。然而目前在单细胞水平上，人们对于senolytics 如何特异性靶向体内的衰老细胞缺乏整体上的认知。以往人和小鼠成纤维细胞中的转录组测序（bulk RNA sequencing，RNA-seq) 数据表明，不同诱因导致的、不同时期的以及不同类型的衰老细胞表现出明显不同的转录组学特征以及SASP类型，从而促进不同的生物学过程。即便是相同培养条件下的人成纤维细胞，在一些衰老相关的基因表达上也表现出细胞间差异。基于这些体外的证据，体内的衰老细胞在不同年纪、性别、组织和微环境中，以及累积速率等方面均可能表现出高度的异质性。但是目前这些推测大多数尚未被证实，因此后续的研究需要借助更多高分辨率的生物学技术，如单细胞测序（single-cell RNA-seq）、单细胞核测序（single-nucleus RNA-seq）或其他单细胞层面的技术，去刻画不同条件下体内衰老细胞的特征。

三、体内衰老细胞异质性的研究模型

一直以来，p16^high 的细胞被视为最主要的衰老细胞群体，因此其被用来研究衰老细胞在各类机体老化相关的疾病中的功能。然而，结合其他衰老相关的标志物如SA-b-gal, SASP因子等，越来越多的证据表明，p16可能既不是一个敏感的也不是一个特异性的衰老标志分子。第一，p16在部分非衰老的细胞类型包括胰腺β细胞（pancreatic β-cells）、巨噬细胞（macrophages）、间叶干细胞（mesenchymal stem cells）、内皮细胞（endothelial cells）中高表达。第二，p16也并非在所有的衰老细胞类型中高表达。此外，目前这些现有的研究模型也存在技术瓶颈。例如在基于p16为靶点设计的小鼠模型中，由于不同的转基因设计策略（例如不同的启动子区域和插入位点），并非所有p16^high的细胞都能够被标记。另外，虽然senolytics被广泛用来验证衰老细胞在体内的功能，但是其具体作用的细胞群体也并未得到鉴定。上述这些难题均限制了我们对于衰老细胞在体内角色的认知。最近，一系列以其他细胞衰老标志物为靶点的研究阐释了衰老细胞的新功能。第一项研究于2021年报道了一种基于p21启动子驱动的诱导型Cre（p21-Cre）表达的转基因小鼠模型[8]。该模型标记的p21^high细胞在年老小鼠的各类组织中占比1-10%，同时表达多种关键的细胞衰老标志分子，与p16^high的细胞群体呈现出明显不同的分布。清除p21^high细胞明显提高年老小鼠的生理功能，减缓肥胖小鼠的代谢功能紊乱[6]。第二项研究通过对三种已知的衰老小鼠的转录组数据集进行差异基因表达分析，鉴定出尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase plasminogen activator receptor，uPAR）为特异性衰老标志物。此外，该研究证实通过chimeric antigen receptor（CAR）T特异性清除uPAR高表达的衰老细胞，能够延长肺腺癌小鼠的寿命[9]。第三项研究通过分析血管内皮细胞的转录组学特征，鉴定出GPNMB为特异性的衰老细胞表面蛋白[10]。在肥胖小鼠中敲除GPNMB显著降低衰老细胞比例并减缓代谢紊乱。此外，特异性识别GPNMB的疫苗也提高一系列衰老相关的健康指标。这些研究表明单一的分子并不足以标记衰老细胞，结合多种衰老标记物则能够更好的确认细胞的衰老状态。因此，这些新型衰老标志物的发现，小鼠模型的建立，以及新型senotytics 的开发，将在后续体内衰老细胞异质性的研究中发挥广泛的应用。

四、目前单细胞层面的高通量衰老细胞检测技术

单细胞/单核RNA测序是目前研究衰老细异质性最强大的工具。这些方法能够高通量地分析每个独立细胞的分子学特征并定义其转录组特性。但是，由于测序深度较高，单细胞测序技术并不能够捕捉到一些体积过大的以及对分离条件较为敏感的衰老细胞。而单细胞核测序技术则能够轻松地捕捉到各种类型的衰老细胞，但是由于核内mRNA丰度较低，其测序敏感度则不如单细胞测序技术。空间转录组分析是一项正在发展中的技术，其能够在小的组织切片中进行RNA-Seq，同时保留这些切片的组织学信息。随着单细胞水平上分辨率的进一步提高（目前分辨率在55 mm,每个切片1-10个细胞），由于空间转录组技术能够捕捉到所有的细胞类型，并提供衰老细胞的三维空间位置信息，在未来将会被应用于更多的衰老细胞异质性的研究。然而，由于上述测序技术深度均相对较低，导致每个细胞内只有最多50-60%的转录本能被检测到，这对于描绘体内较低丰度的衰老细胞群而言是一个挑战。通过流式分选或其他技术进一步富集衰老细胞可能有助于提高测序灵敏度，但同时也需要更强大的衰老标志物。除了高通量测序技术外，文中也讨论了一些高通量RNA测序数据的分析方法。这些测序技术与分析方法的结合则共同促进人们对于衰老细胞异质性的了解。

除了上述高通量的测序方法，高灵敏度的检测方法同样十分有价值。基于多重抗体的成像方法（multiplexed antibody-based imaging，mABI）例如成像型质谱流式系统（imaging mass cytometry）和CODEX蛋白组学分析（codetection by indexing）等，能够在一个细胞内同时检测20-50个目标蛋白。由于衰老细胞的转录组与蛋白组数据集相关性较差，这类方法可以作为基于转录组的检测方法的补充。此外，多重荧光原位杂交（multiplex fluorescence in situ hybridization，mFISH）技术也能够在单分子水平上同时检测多于100个目的基因，可以用于进一步验证基于单细胞测序鉴定出的靶标基因，同时评估衰老细胞微环境。成像流式细胞术（imaging flow cytometry）作为另一种有价值的技术，目前已应用于检测体内衰老细胞[6,8]。该方法的优势在于其在检测一些衰老相关标识蛋白的同时，也能在单细胞水平上评估如SA-b-gal、细胞体积、增殖、DNA损伤灶（DNA damage foci）以及细胞质DNA的存在等衰老特征，而这些是测序技术所无法检测的。

五、单细胞水平上的组织衰老异质性

作者们在最后一部分列举了在脂肪大脑、肝脏、肾脏以及眼等组织中，基于高分辨率单细胞测序技术开展的相关研究及重要进展。在衰老和肥胖小鼠的脂肪组织中，p21^high与p16^high的细胞在细胞类型、组织分布、积累速率以及生理功能方面均表现出明显的不同[6, 8]。另外，通过成像细胞术表明，p21^high的脂肪细胞表现出明显的衰老特征。进一步地，通过年轻和年老小鼠的间叶干细胞（源于脂肪组织）进行单细胞测序分析发现，与体外细胞实验结果一致，体内p21^high细胞表现出一系列信号通路的上调，如SCAPs、SASP、NF-κB、HMGB1和FOXO通路等。在年轻健康的小鼠肝脏中，p16在内皮细胞与Kupffer细胞中高表达。而在非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis）的小鼠肝脏中，p16主要在巨噬细胞中高表达。在年轻健康的小鼠肾脏中，p16主要在上皮细胞中高表达。在年老小鼠的海马体中、小胶质细胞、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞中均有p21^high与p16^high细胞富集且表现出异质性。上述研究表明，p16与p21在不同组织的不同衰老细胞类型中均表现出明显的异质性，且p21^high与p16^high细胞标记的衰老细胞类型相对有限，所以，仅仅使用p21或p16作为标识分子是远远不够的。近两年的研究也证实了这一点。例如，在人大脑中，通过对阿尔兹海默症病人样本进行单细胞核测序发现p19/CDKN2D在衰老细胞中高表达，该结果进一步通过mFISH和mABI得到确认。在一项对增殖性视网膜病小鼠模型的单细胞测序研究中，鉴定出一群高表达Col1a1的衰老内皮细胞群，并能够被senolytics 特异性清除。在2020年，一项包含23种不同时期小鼠组织的单细胞测序数据库Tabula Muris Senis完成[11]。该单细胞数据库表明，衰老细胞分布于各类不同的细胞群体，并在衰老过程中表现出一系列分子如p16、E2f2、Lmnb1、Tnf和Itgaf等的改变。因此，后续体内的研究需要综合目前已知的衰老特征，进一步发现新的衰老标志物，从而更好的理解衰老细胞的异质性。

总结与展望

在本文中，作者们首先结合现有的衰老小鼠研究模型分析细胞衰老领域的研究现状，指出体内的衰老细胞具有高度的异质性。进而讨论目前研究细胞衰老异质性的技术方法，并分析这些方法的优缺点。最后评述了利用单细胞测序等高通量技术开展的衰老细胞异质性的最新研究进展。作者们指出，为了更好的理解衰老异质性，发现更特异的新型衰老标识物，未来需要建立更多的动物模型，并且进一步优化提高现有的检测技术。此外，不同组织来源的衰老细胞表现出明显不同的衰老标识分子，因此后续的研究需要通过多种高通量测序、影像技术相结合的方法，使用多种现存的衰老标志物去定义和检测新型的衰老细胞群。

原文链接：DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2022.04.011 

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参考文献（上下滑动阅读）  

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本文完